1、支原體培養
一般為泌尿生殖試子或刷片， 少數取前列腺液， 精液、關節液， 或取輸卵管， 直腸活檢物， 近年來用初段尿標本離心物， 以取代尿道拭子。
2、血清學鑒定法
最常用的是瓊脂擴散法， 即將支原體接種到瓊脂皿上。 然後再用浸過適量血清的濾紙放到瓊脂表面， 觀察哪一種能抑制支原體生長。 也可用瓊脂表面的菌落作螢光抗體染色法， 用落射螢光顯微鏡觀察， 此法的優點是可以利用最初生長在瓊脂表面上的菌落而不必將支原體傳代。
3、基因診斷
利用DNA探針對支原體診斷其敏感性稍差，
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