急性病毒性腦膜炎的診斷主要依靠臨床表現和腦脊液化驗檢查, 在排除其他病原因數所致的腦膜炎, 特別是有積極治療手段的腦膜炎後可以得出。 病毒性腦膜炎必須鑒別的情況有細菌性腦膜炎的早期, 治療不完全的細菌性腦膜炎, 蛛網膜下腔出血, 其他原因的無菌性腦膜炎, 結核性腦膜炎, 真菌性腦膜炎, 寄生蟲腦膜炎, 新生物和膠原疾病等。
腦脊液中病毒抗原的分析, 諸如乳酸鹽, 溶菌酶(lysozyme或muramide), C-反應蛋白, 肌酸磷酸激酶等檢查都不敏感到足以區分病毒和細菌性腦膜炎;其他檢查如血常規,
絕大多數病毒性腦膜炎實際上沒有必要作出確切病原診斷, 因為其為良性自限性病程, 治療上只需對症治療, 不需要用抗生素。 若為確定病原, 可以從腦脊液分離病毒; 急性期和恢復期血清標平的血清中檢查和檢出腦脊液中的IgM抗體或病毒抗原。 近年應用免疫和DNA探針擴充技術, 如多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction, PRC)檢出抗原有一定前途,