確定內口位置對明確肛瘺診斷非常重要。 肛門指檢時在內口處有輕度壓痛， 有時可捫到硬結樣內口及索樣瘺管。 肛鏡下有時可發現內口， 自外口探查肛瘺時有造成假性通道的可能， 宜用軟質探針。 以上方法不能肯定內口時， 還可自外口注入亞甲藍溶液1~2ml， 觀察填入肛管及直腸下端的白濕紗布條的染色部位， 以判斷內口位置；碘油瘺管造影是臨床常規檢查方法。
對於複雜、多次手術的、病因不明的肛瘺患者， 應做鋇灌腸或結腸鏡檢查， 以排除Crohn病、潰瘍性結腸炎等疾病的存在。
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