一、細菌學檢查：
嗜血桿菌屬革蘭氏陰性桿菌， 培養條件顯示多形性特徵， 易染性， 此菌無芽孢， 無運動。
1．鏡檢：從軟下疳開放性潰瘍取材塗片標本染色， 杜克雷嗜血菌易檢出， 未破潰病灶從膿腫或橫痃中穿刺， 取其穿刺液塗片標本染色也易檢出， 更為典型， 用美藍染色或革蘭氏染色等鏡檢用10×；100倍油浸觀察。
2．培養檢查：軟下疳菌分離培養較為困難， 故在採取病變材料時應注意取軟下疳潰瘍邊緣下貯留膿汁或穿刺橫痃抽吸的膿汁作為檢體， 或再用生理鹽水充分洗滌潰瘍底面後， 再用生理鹽水濕棉簽塗抹標本送化驗室培養。
國際上軟下疳的標準培養基一種是GCHGS（Hammondgonococcalmedia）， 由淋球菌瓊脂培養基加牛血紅蛋白、胎牛血清、萬古黴素及纖維素、氨基酸等組成；另外一種是MHHb（Muller-Hinton瓊脂， 由Muller-Hinton瓊脂、馬血、萬古黴素及其他培養成份組成）， 上述兩種培養基可以同時應用， 以提高陽性率。
菌落常於接種後24-48小時形成。 色灰黃而透亮， 直徑約為1-2mm。 從菌落處取材作革蘭染色陰性， 為成雙的短桿菌， 成鏈狀排列。 同時應作生化反應以鑒定之。 主要有：氧化酶試驗弱陽性， 過氧化酶試驗陰性， 非卟啉試驗陰性， 硝酸鹽還原試驗陽性， 鹼性磷酸酶試驗陽性。
杜克雷嗜血桿菌的培養不僅有助於診斷， 而且可確定分離的細菌對抗生素的敏感性， 目前已分離出耐抗生素的杜克雷嗜血桿菌。
二、血清學診斷軟下疳
感染杆克雷嗜血桿菌能產生抗體， 通過血清學檢查， 不論是補體結合， 凝集反應以及螢光抗體間接法等均可證實， 但尚未推廣， 目前認為IgM抗體敏感性為74%， IgG抗體敏感性為94%， 其特異性分別為84%和64%。
三、PCR檢測杜克雷嗜血桿菌。
